AAVの安定性
課題
AAVキャプシドは製造中または保存中に分解したり凝集することがあるため、AAVキャプシドを安定に保つことは、中のペイロードを必要な場所に運ぶために非常に重要です。薬剤の投与後も、キャプシドの安定性は、AAVが想定どおりにペイロードを放出することを保証するための重要な要素となります。
AAVがどのようなタイミングで破壊されたり凝集したりするかを測定するには、通常、多くのツールを組み合わせる必要があり、複雑な技術として、時間がかかったり、また大量のサンプルを必要としたりします。トランスダクションアッセイや感染性アッセイのような機能的アッセイには何日もかかり、高度なスキルを持つユーザーを必要とします。また、電子顕微鏡を使用する方法は当然ながら高コストであるだけでなく、低スループットでもあります。完全なキャプシド濃度（タイター）を測定できるELISAや、ゲノム定量を調べるqPCRのようなルーチンアッセイでさえ、数時間かかることがあり、キャプシドの安定性についての洞察を得るには、複雑に設計された実験が必要です。
ソリューション
Uncle は、簡単かつ迅速に少量のアッセイでAAVの安定性を調べることのできる他に類を見ないソリューションです。サーマルランプ試験をフルスペクトル蛍光および静的光散乱（SLS）と組み合わせ、キャプシド、タンパク質、DNAの挙動をすべて同じ装置・同じ実験で調べて安定性の洞察を提供できます。結果はわずか9μLで2時間未満で得られるため、より多くの候補化合物、製剤、条件をスクリーニングし、どれが最も安定しているかを迅速に把握することができます。
実証データ
概要
AAVとSYBR Gold®染料を組み合わせて、Uncle上で示差走査蛍光測定（DSF）実験を行う場合、AAVキャプシドがゲノムを失い始める温度を特定することができます。これはゲノム放出（またはAAVのアンコーティング）と呼ばれ、AAVではキャプシドタンパク質が展開して凝集するかなり前に起こります。SYBR Goldの蛍光強度は、実験開始時に分解されたAAVからDNA、またはサーマルランプ実験中にAAVキャプシドから放出されたDNAなど、遊離DNAが多いと増加します。凝集が始まる温度は、SLS強度の急激な増加で簡単に追跡することができます。
- キャプシドの安定性は下記のように多くのことに左右されます。
- 血清型または組み換え型キャプシド配列
- パッケージ化されたゲノム長
- ゲノムが一本鎖か自己相補的となっている場合
- 製剤バッファー
- キャプシドの化学的安定性（アミド分解など）
Uncleは、AAV遺伝子治療ベクターの安定性に対するそれぞれの影響を効率的に評価し、ゲノム放出、キャプシドタンパク質のアンフォールディング、凝集を検出することで、安定性に影響を及ぼすさまざまな要素について洞察を提供します。
製剤の最適化
最良の製剤緩衝液（バッファー）は、AAVキャプシドができるだけ長くゲノムを保持できるように設計されたものであるでしょう。賦形剤からpHに至るまで、製剤にはキャプシドの安定性を助けたり、妨げたりする様々な要素があります。
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